PCR技术可用于：

       （1）检验感染性疾病是否处于隐性或亚临床状态；

       （2）有效检测癌基因的突变，准确检测癌基因的表达量；

       （3）临床应用于检测地中海贫血的基因突变。

        实验方法原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
 

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

        ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；
 
       ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
 
        ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
 
        重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 

       实验材料 模板DNA  

       试剂、试剂盒 dNTP Taq DNA聚合酶 蒸馏水 PCR缓冲液 引物 氯化镁  

       仪器、耗材 PCR仪 移液枪 PCR板 薄壁管 离心管 离心管盒  

实验步骤：

 一、标准的PCR反应体系
 
       10×扩增缓冲液 　   10 ul
 
       4种dNTP混合物 　 各200 umol/L
 
       引物 　　　　 　     各10～100 pmol
 
       模板DNA 　　　 　0.1～2 ug
 
       Taq DNA聚合酶 　  2.5 u
 
        Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L
 
       加双或三蒸水至 　  100 ul
 
二、PCR引物设计

       PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

       1.   引物设计的基本原则

       （1）  引物长度：15-30 bp，常用为20 bp左右。

       （2） 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

       （3） 引物内部不应出现互补序列。
 
       （4）两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。
 
       （5） 引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
 
       （6）引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

       （7） 引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

       2.   引物设计软件

       Primer Premier5.0 （自动搜索）*、Oligo6 （引物评价）、Vector NTI Suit、DNAsis、Omiga、DNAstar、Primer3 （在线服务）。

三、模板的制备

       （1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

       （2）模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

       （3）标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

    pcr实验步骤

       （本文来源丁香通）