聚合酶链式反应（PCR）（三）
其他
一、 PCR反应的关键环节
1. 模板核酸的制备。
2. 引物的质量与特异性。
3. 酶的质量。
4. PCR循环条件。
二、 PCR常见问题及对策
1. 假阴性，不出现扩增条带
（1）模板原因
① 模板中含有杂蛋白质。
② 模板中含有Taq酶抑制剂。
③ 模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白。
④ 在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。
⑤ 模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处 理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
（2）酶失活
① 需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。
② 忘加Taq酶或溴乙锭。
（3）引物
① 引物质量。
② 引物的浓度。
③ 两条引物的浓度是否对称。
解决对策：
① 选定一个好的引物合成单 位。
② 引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。
③ 引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。
④ 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
（4）Mg2+浓度
① 浓度过高降低PCR扩增的特异性。
② 浓度过低影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
（5）反应体积的改变
① 通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定;
② 在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
（6）物理原因
① 变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性。
② 退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。
③ 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度有问题。
（7）靶序列变异
① 靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合。
② 靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列。
2. 假阳性，出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
（1）引物设计不合适
① 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性。
② 靶序列太短或引物太短。
（2）靶序列或扩增产物的交叉污染
① 整个基因组或大片段的交叉污染。
解 决方案：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
② 空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。
解决方案：可用巢式PCR方法来减轻或消除。
3. 出现非特异性扩增：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
（1） 引物与靶序列不完全互补或引物聚合形成二聚体。
（2） Mg2+离子浓度过高。
（3） 退火温度过低。
（4） PCR循环次数 过多有关。
（5） 酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。
其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
4. 出现片状拖带或涂抹带
（1）原因
① 酶量过多。
② 酶的质量差。
③ dNTP浓度过高。
④ Mg2+浓度过高。
⑤ 退火温度过低。
⑥ 循环次数过多引起。
（2）对策
① 减少酶量。
② 调换另一来源的酶。
③ 减少dNTP的浓度。
④ 适当降低Mg2+浓度。
⑤ 增加模板量。
⑥ 减少循环次数。
pcr实验步骤
（本文来源丁香通）
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