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细胞实验技术

Transwell侵袭实验总结之操作步骤

 一、将小室放入培养板中


       在上室加入300 µl预温的无血清培养基,室温下静置15-30 min,使基质胶再水化。再吸去剩余培养液。


二、制备细胞悬液


       ① 制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24 h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。

       ② 消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,用PBS洗1-2遍,用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至1-10×10,个人认为不要超过5×10。具体实验时采用密度要自己摸索,因为不同细胞,其侵袭能力是不同的。个人经验,细胞量过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果最后用计数法统计结果的话将难以计数;而过少的话,可能还没到检测的时间点,所有的细胞都已穿过,因此最少也要保证在收样的时候,上室内还要有一定量的细胞存在。


       个人认为,对照组和处理尽量不要分开计数,因为细胞数目的差异会严重影响实验结果。如果需要对细胞预处理而不得不分开计数,那么计数一定要多重复几次,力求准确,尽量保证对照组和处理组细胞密度一致。


三、接种细胞


       ① 取细胞悬液100-200 µl加入Transwell小室,不同公司的、不同大小的Transwell小室对细胞悬液量有不同要求,请参考说明书。24孔板小室一般200 µl。

       ② 24孔板下室一般加入500 µl含FBS或趋化因子的培养基,不同的培养板加的量有不同要求,具体请参考说明书。这里要特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。

       ③ 培养细胞:常规培养12-48 h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。


       以我的课题为例,我使用的药物不仅会抑制肿瘤细胞侵袭力,还对细胞增殖有明显抑制。我选择的药物浓度是用MTT筛选出的72 h的IC50。用这个浓度处理细胞,24 h内对细胞增殖并无明显抑制,但24 h后,抑制作用就开始出现了。


       所以,用这个浓度来做Transwell,处理时间也必须限定在24 h内,否则一旦药物抑制了细胞增殖或者诱导出凋亡,使处理组细胞数目少于对照组,那么就难以肯定穿过膜的细胞比对照组少,究竟是由于侵袭被抑制引起,还是处理后细胞数目本身就比对照组少而引起的了。


       时间过长不可以,同样,过短也不行,因为细胞内会有一定量的MMPs储存,短时间内可能侵袭能力不会有太大改变。同时从药物被吸收进去,进而发挥作用,影响MMPs表达,到最后释放到培养基中,还需要一个过程。时间点的选择可尽量长点,也可选择多个时间点研究时间依赖效应,但前提是这个时间范围内细胞数目不能有明显变化。另外,我看到细胞在小室内的形态不是正常培养贴壁的形态,而是圆形的,仍是悬浮时的形态,不过会聚集成团,所以看到细胞不正常贴壁也不要紧张,是正常现象

       在培养过程中,膜下会逐渐有少量小气泡产生,这是正常现象,可不予处理,但我遇到过培养一段时间后,膜下出现了大气泡,幸亏及时发现,否则后果将非常严重。因此,个人建议,最好接种细胞后1-2 h把培养板从培养箱里拿出来看看,确信没有大气泡产生。

        Transwell侵袭实验


       (本文来源丁香通)

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