蛋白表达

实验材料：

       表达靶蛋白的大肠杆菌细胞试剂、试剂盒：细胞裂解缓冲液I、细胞裂解缓冲液Ⅱ、脱氧胆酸、浓盐酸、包涵体溶解缓冲液I、包涵体溶解缓冲液Ⅱ、KOH、PMSF、SDS 凝胶加样缓冲液、含尿素的Tris-Cl、DNaseI、溶菌酶、SDS-聚丙烯酰胺凝胶仪器、耗材：Sorvall GSA 转头或相当的转头、pH试纸、磨光玻璃棒

实验步骤材料：

       1、缓冲液和溶液 

       2、贮存液、缓冲液和试剂的成分请参见附录 1。贮存液稀释至适当浓度。

       3、细胞裂解缓冲液 I 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1mmol/LEDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl

       4、细胞裂解缓冲液Ⅱ, 冰冷 50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0) 10 mmol/L EDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl 0.5% TritonX-100

       5、脱氧胆酸使用蛋白级的胆酸/去污剂。

       6、HCl(12mol/L)(浓盐酸）

       7、包涵体溶解缓冲液 I 50 mmol/LTris-Cl(pH8.0) 1 mmol/LEDTA(pH8.0) 100 mmol/LNaCl 8mol/L 尿素 0.1mol/LPMSF 缓冲液现用现配。

       8、包涵体溶解缓冲液Ⅱ 50 mmol/LKH2PO4(pH10.7) 1 mmol/LEDTA(pH8.0) 50 mmol/LNaCl

       9、KOH(10mol/L)

       10、PMSF(100 mmol/L) 

       11、1x 和 2XSDS 凝胶加样缓冲液 不含 DTT 的 1x 和 2xSDS 凝胶加样缓冲液室溫保存， lmol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。

       12、含尿素的 Tris-Cl(0.1mol/L,pH8.5) 仅限于方法 2 使用，请见步骤 7。配制内含尿素浓度递增（如 0.5、1、2 和5mol/L) 的0.1mol/L Tris-Cl(PH8.5)。使用前用固体尿素现用现配，不能使用任何尿素贮存液，因为尿素容易分解。

       13、酶和缓冲液 

       14、DNaseI(1 mg/ml)

       15、溶菌酶（10 mg/ml)

       16、用 Tris-Cl(PH8.0) 现用现配。

       17、凝胶

       18、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%) 用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备请参考附录 8

       19、离心机和转头 20Sorvall GSA 转头或相当的转头 特别配备

       20、pH 试纸 备用，请见步骤 10。

       21、磨光玻璃棒

       22、载体和细菌菌株

       23、表达靶蛋白的大肠杆菌细胞 培养 1L 以包涵体形式表达靶蛋白的大肠杆菌细胞方法制备细胞抽提物 1.1L 表达细胞培养物于预先称重的离心管中 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min。

注意：

       1.步骤 2~4—定要在 4°C 进行。

       2. 吸去上清，称菌体沉淀的重量，每克（湿重）菌体加入 3 ml 细胞裂解缓冲液 I，轻轻旋动或用磨光玻璃棒搅动，使菌体悬起。

       3. 每克（湿重）菌体加入 4ul 100 mmol/LPMSF,80ul 10 mg/ml 溶菌酶，搅动 20 min 也可以加入其他蛋白酶抑制剂混和物（见方案 1)。

       4. 每克（湿重）菌体加入 4 mg 脱氧胆酸，继续搅动。

       5. 悬液 37°C 放置，不时用磨光玻璃棒搅动，待其变黏时每克（湿重）菌体加入 20ul 1 mg/ml DNaseI。

       6. 裂解液室温放置，直至不再黏稠（约 30 min)。纯化和洗涤包涵体

       7. 用下述两种方法之一纯化和洗涤包涵体。

方法 1: 用 Triton X-100 提取包涵体下述流程是对 Marston 等（1984) 所用方法的改进。

        a. 细胞裂解物 4°C 高速离心 15 min。

        b. 倾倒去除上清，沉淀重悬于 9 倍体积的 4°C 细胞裂解缓冲液Ⅱ。

        c. 悬液室温放置 5 min。

        d. 高速离心 15 min。

       e. 倾倒上清，留置待用。沉淀重悬于 100ul 水。

       f. 各取 10ul 上清和沉淀，分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶蛋白的分布。

      g. 必要时继续步骤 8 溶解包涵体。 

方法 2: 用尿素提取包涵体下面的程序是用含有不同浓度尿素的缓冲液洗涤和溶解包涵体，摘自 Schoner 等 (1985)。

       a. 细胞裂解物 4°C 高速离心 15 min。注意：步骤 b、d 和 f 必须在 4°C 进行。

       b. 倾倒去除上清，每克（湿重）菌体沉淀重悬于 1 ml 水中。每支 100ul 装 4 支离心管，其余 4°C保存。     

       c. 4°C 高速离心 15 min。

       d. 毎份沉淀重悬于 100ul 含不同浓度（如 0.5、1、2 和 5mol/L) 尿素的 0.1mol/L Tris-Cl(pH8.5)。

       e. 4°C 高速离心 15 min。

        f. 倾倒上清，留置待用，每份菌体沉淀重悬于 100ul 水中。

        g. 各取 10ul 上清和沉淀，分别与 10ul 2XSDS 凝胶加样缓冲液混和，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析哪个浓度的尿素洗涤效果最佳。

         h. 用步骤 g 确定的最佳浓度，按上述方案洗涤剩余包涵体沉淀（步骤 b)。

         i. 必要时继续步骤 

        8 溶解包涵体。溶解包涵体8. 取适量步骤 7 的重悬细胞沉淀，4°C 高速离心 15 min, 沉淀重悬于 100ul 含 0.1 mmol/LPMSF(现用现加）的包涵体溶解缓冲液 I。

        9. 室温放置 lh。

        10. 把溶液加入到 9 倍体积的包涵体溶解缓冲液 II 中，室温放置 30 min。检査 pH 是否维持在 10.7,必要时用 10mol/LKOH 调节。

        11. 用 12mol/L 盐酸将溶液 pH 调至 8.0, 室温放置至少 30 min。

        12. 室温高速离心 15 min。

        13. 倾倒上清，留置待用，沉淀重悬于 100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液

        14. 取 10ul 上清与 10ul 2xSDS 凝胶加样缓冲液混和，上清和沉淀分别进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析溶解程度，继续附加方案。

蛋白表达纯化服务 

       （本文转载丁香通）