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制作石蜡组织切片标本的体会

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       在制作石蜡组织切片标本的实践中,笔者体会到要做出质量好的组织切片标本,必须把握制作中的每个环节。为确保组织切片标本制作的顺利进行,现将操作要点介绍如下。


1. 取材


       动物处死后,应快速取出所需的组织。取材的刀要锋利,严禁用手或镊子挤压,以免损伤组织。切取的组织块厚度一般为0.5~1.0cm,大小1.5~2.0cm,以免影响固定效果。


2. 固定


       固定是将组织块用化学试剂浸泡,使组织内的蛋白质等成分迅速凝固或沉淀,停止细胞濒死前或死亡后的变化。同时组织固定后不易变形,有利于以后的组织处理。所以组织一旦离体必须及时固定,固定液的量大约为组织的5倍。常用10%的福尔马林、zenker氏等固定液。固定时间约为24h。

3. 冲洗


       固定好的组织块需经流水冲洗24h,冲洗不彻底容易造成脱片和染色不佳。对需做免疫组织化学的组织,更不能忽视这一步骤。


4. 脱水和透明


       脱水就是利用脱水剂将组织内的水分置换出来,以利于有机溶剂的渗入。脱水是否彻底,直接关系到组织能否充分透明。脱水一般采取上行梯度酒精,从80%酒精、95%酒精至无水酒精。还要注意组织在无水酒精内时间过久,容易发脆,一般约为4h。


       组织块脱水后就进入透明步骤,即经过一种既能与脱水剂混合,又能与石蜡相溶的媒介物质。目前最好的透明剂是二甲苯,但二甲苯容易使组织发脆,所以在二甲苯中时间也不宜过长,一般40~60min。


5. 浸蜡


        组织透明后,在熔化的石蜡内浸渍的过程称为浸蜡。浸蜡温度过高(超过70℃),会导致组织发硬,还会使组织内的抗原受到破坏。浸蜡用的石蜡熔点一般在56℃~60℃,浸蜡温度控制在60℃~70℃。


       浸蜡时间的长短直接影响组织切片,不同的组织浸蜡时间不同,通常较脆组织如肝、甲状腺、脾等浸蜡2~3h,含有结缔组织的器官如胃、膀胱、肠等浸蜡时间要延长6h。所用的石蜡如有杂质尽可能过滤,以防附着在组织上,影响切片与观察。


6. 包埋


       用包埋剂来支持组织的过程称为包埋。最常用的是石蜡包埋法。包埋的关键是平整和方位。包埋时,要求用镊子轻压组织块拱起部份,使之平贴于底部,通常采用组织的最大面包埋;囊壁、管腔组织应竖直包埋。修去两边的余蜡(指切片时与切片刀垂直的两侧)。


7. 切片


       切片的第一步需粗切。粗切的厚度20~40μm,粗切至组织全部暴露后,再进行细切。细切至组织块表面均匀一致,无白点。切片时要求用力均匀、柔和,切片厚度一般为3~5μm,切下的蜡膜大小、形状应与组织块上的组织大小形状一致。


       如气温较高,石蜡组织块较软可用冰块局部冰冻(操作状态下),使组织块变硬便于做连续性切片;如气温较低、石蜡组织块较硬时可用大拇指热敷或用嘴吹气加温,使组织块变软再做连续性切片。


8. 展片与捞片


       把切片放入温水中展开即为展片。展片水温应在48℃~55℃,这主要和包埋蜡的熔点有关:水温过高,会引起组织细胞散开;水温过低,切片皱摺无法摊平。展开片子上的皱摺,有两个方法:①在切片时边切边向蜡片吹气,这样片子放到热水里会自然展平;


       ②切片结束后,先把切片放在30%酒精水溶液中,让酒精的张力自动把皱摺展开,然后再将切片移到热水中,酒精浓度不宜过高,否则容易引起切片破碎,出现裂隙。脂肪类组织遇到酒精会散开,故不能用此法。捞片时,要选择那些完整、无皱摺的切片,粘贴于载玻片上。


9. 烤片和脱蜡


       烤片是烤干切片上多余的水分和石蜡,并使切片与载玻片牢固粘贴。一般在60℃的温箱内进行,温度过高,会引起切片的组织细胞收缩;时间太短(少于20min),容易造成脱片。


       脱蜡也相当重要,如果脱蜡不干净,切片不易着色或着色不匀。所以在脱蜡过程中,脱蜡剂(松节油)要常更换(用15~20次)。烤片结束后立即将切片放在温箱内预热(40℃~45℃)的松节油Ⅰ、Ⅱ中15min,然后经下行梯度酒精洗去松节油至水。


10. 染色


       按常规的HE染色。染色理想的切片在显微镜下应是细胞核与细胞质蓝红相映,色泽鲜艳,核浆对比明显,核膜及核染色质颗粒清晰可见。


11. 脱水和封片


       切片脱水采用上行梯度酒精。浓度低的酒精比浓度高的酒精更容易脱水,但也容易使伊红退色,故脱水时间要短(1~2min),也可无须用酒精脱水而直接晾干。切片经二甲苯透明。用中性树胶封片,一定要避免气泡的产生。


       (本文转载丁香通)

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