代做生物实验

1. 适用范围

       本标准规定了禽流感的血凝试验、血凝抑制试验。

2.  血凝试验

2.1  材料与试剂

       2.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、注射器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。

       2.2.2  pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，配制方法参见附录A。

       2.2.3  1%鸡红细胞悬液，配制方法参见附录B。

       2.2.4  阿氏液，配制方法参见附录C。

       2.2.5  标准禽流感病毒抗原，购入的标准禽流感病毒应检测其血凝效价并进行无菌检验，以检查与所标HA效价是否相符。若不符，应重复检测并到相关实验室验证。

2.2  操作程序

       A. 取96孔V形微量反应板，用微量移液器在1~12孔每孔加25 μL PBS，共滴8排，后四排的第1列孔再补加25 μL PBS。

       B. 吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第1列孔中，吹打3~5次充分混匀。

       C. 从第1列孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2列孔中，混匀后吸取25μL加入到第3列孔中，依次进行系列倍比稀释至第11列孔，最后从第11列孔各吸取25 μL弃之，设第12列孔为红细胞对照。

       D. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。

2.3  结果判定

       A. 在红细胞对照孔出现正确结果的情况下，将反应板作45°倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）。

3  血凝抑制试验

3.1  材料与试剂

       3.1.1  器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、煮沸消毒器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器及96孔V形血凝反应板。

       3.1.2  pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制方法参见附录A。

       3.1.3  1%鸡红细胞悬液配制方法参见附录B。

       3.1.4  阿氏液，配制方法参见附录C。

       3.1.5  4单位抗原，制备方法参见附录D。

       3.1.6  HA效价高于10log2时可继续增加稀释的孔数。

3.2  操作程序

       A. 根据血凝试验结果配制4单位抗原。以能引起100%血凝的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位，4单位抗原的的配制方法如下：假设抗原的血凝滴度为1:256（28），则4单位抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4），稀释时，将1 mL抗原加入到63 mL PBS中即为4单位抗原。但是该4单位抗原必须经过验证（如附录D  4单位抗原的标定）后才可确定其稀释倍数，用于血凝抑制效价的测定。

       B. 取96孔V形微量反应板，用移液器在第1~11孔各加入25 μL PBS，第12孔加入50 μL PBS。

       C. 在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，第10孔弃去25 μL，设第11孔为病毒对照，第12孔为红细胞对照。

       D. 在第1~11孔各加入25 μL 4单位抗原，轻叩反应板，使反应物混合均匀，室温20-25℃下静置30 min。

       E. 自右向左依次向各孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。

       F. 将反应板置于微量振荡器上振荡1 min，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃静置60 min，红细胞对照孔成明显的纽扣状沉到孔底时即可判定结果。

3.3  结果判定

       A. 在红细胞对照出现完全沉淀、病毒对照出现完全凝集的情况下，将反应板作45°倾斜，从反应板背侧观察。以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。

附录A

       pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)配制

       氯化钠（NaCl）

       氯化钾（KCl）

       磷酸氢二钠（Na2HPO4）

       磷酸二氢钾（KH2PO4）

       加蒸馏水至

附录B

       1%鸡红细胞悬液配制

附录C

       阿氏液的配制

       葡萄糖（C₆H₁₂O₆．H2O)

       柠檬酸三钠（Na₃C₆H₅O₇.2H2O)

       柠檬酸（C₆H₈O₇.H2O）

       氯化钠（NaCl)

附录D

       4单位抗原的制备

       根据血凝试验测定的血凝效价，判定4个血凝单位的稀释倍数，并作复归试验。例如：病毒2倍倍比稀释时的HA效价为9log2，3倍时的HA效价为8log2，其4个血凝单位为6log2~7log2，则将病毒在96~128倍稀释。

       则可以假定90×，100×，110×，120×，130×为4HAU，分别再作2×、3×、4×、5×、6×稀释，每个4个孔，并作红细胞和病毒对照，依此做一次血凝实验，从而确定4单位抗原。判定时4×的半数100%凝集则为4单位抗原，1个100%凝集说明稀释倍数偏大，3个100%凝集稀释倍数偏小。

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       （本文转载丁香园）