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细菌基因组DNA的提取方法

 一.   服务介绍                          

       细菌基因敲除

       实验原理


       真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来制备基因组 DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。


       提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。


       在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性;而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。


  二.实验仪器以及试剂                    


       1. 仪器:


       恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计(GeneQuant)、移液器、玻璃匀浆器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)


         2. 试剂:


      (1)细胞裂解缓冲液:


       Tris (pH8.0) 100 mmol/L


       EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L


       NaCL 20 mmol/L


       SDS 10%


       胰RNA酶 20ug/ml


    (2) 蛋白酶K: 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,?C20℃备用。


    (3)TE缓冲液(pH 8.0):高压灭菌,室温贮存。


    (4)酚?氯仿?异戊醇(25:24:1)、


    (5)异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。


  三.实验方法以及步骤                    


        1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混匀。


       在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12~24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。


       2.加2倍体积异丙醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100ul 吸头挑出,凉干,用200ul TE 重新溶解。(可进行PCR反应等,需要进一步纯化的按下列步骤进行)


       3.加等量的酚?氯仿?异戊醇振荡混匀,离心12000 rpm,5min。 


       4.取上层溶液至另一管,加入等体积的氯仿?异戊醇,振荡混匀,离心12000 rpm,5min。 


       5. 取上层溶液至另一管,加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min。


       6.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。


       7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm , 5min。


       8.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥。


       9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或?C20℃保存备用。


       10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。


       常见问题


       1.选择的实验材料要新鲜,处理时间不易过长。


       2.在加入细胞裂解缓冲液前,细胞必须均匀分散,以减少DNA团块形成。


       3. 提取的DNA不易溶解:不纯,含杂质较多;加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥,也将使溶解变得很困难。


       4. 电泳检测时DNA成涂布状:操作不慎;污染核酸酶等。


       5.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8;不纯,含有蛋白质等杂质。在这种情况下,应加入SDS至终浓度为0.5%,并重复步骤2~8。


       6.酚/氯仿/异戊醇抽提后,其上清液太黏不易吸取:含高浓度的DNA,可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。 


       基因组DNA提取方法2008-10-23 18:43制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤,通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。


       在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法,其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。2化学方式:异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等


       试验步骤:


       1、贴壁细胞用胰酶消化,离心收集。


       2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次,离心收集。试验步骤2再重新作一边。


       3、加入5mlDNA提取缓冲液,(10mmol/LTris-cl0.1mol/LEDTAo.5%SDS)混匀。


       4、加入25ul蛋白酶K使终浓度达到100ug/ml混匀,50℃水浴3h


       5、用等体积的酚抽提一次,2500rpm离心收集水相,用等体积的(酚,氯仿,异戊醇)混合物抽提一次,2500r/min离心收集水相


       6、用等体积的氯仿,异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL混匀,冰浴,10min.。


       7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm离心10min。弃上清。


       8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。


       9、12000r/min室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术


       分离外周血白细胞提取方法:


       试验步骤:


       1、取人肘静脉血5ml,EDTA抗凝,2500rpm离心10min。


       2、小心吸取上层血浆,分装到3个0.5ml离心管中。


       3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液,摇匀,冰浴15min。


       4、2500rpm离心10min,弃上清。


       5、加入10ml溶血液,摇匀,冰浴15min。


       6、3000rpm离心10min,弃上清。


       7、倒置离心管,去掉残液。


       8、得白细胞,-80?C冻存。


       试验要求:


       血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h,4℃放置不超过5h,以防白细胞自溶。


       (本文转载百度学术)

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