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SPA的提取

 一.   服务介绍                          

       金黄色葡萄球菌A蛋白提取

       金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分,几乎90%以上的菌株均含有这种成分,但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%,通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。 


        (一) SPA的理化性质    SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸,所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65,等电点为pH5.1。SPA十分稳定,用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件,以及加热煮沸均不影响其活性。其分子量因测定方法不同而有所差异。


       SPA蛋白提取的方法很多,包括煮沸法、溶菌酶法、葡萄球菌溶素法、超生波法以及三氯醋酸法等。

       

二.实验方法以及步骤                     

     

1.煮沸提取法


       ⑴ 将菌株接种于蛋白胨葡萄糖琼脂培养基上,37℃培养20h~24h。
       ⑵ 以0.15mol/L pH5.9PB液将菌苔洗下,配成10%(V/V)的悬液。
       ⑶ 水浴中煮沸1h,迅速冷却至4℃,4000r/min离心20min,去沉淀。
       ⑷ 以1mol/LHCl将上清液调pH至3.0~3.5,然后4000r/min离心30min。
       ⑸ 沉淀以pH5.9PB溶解,然后12 000r/min离心20min。
       ⑹ 上清液加4.7倍量的95%酒精,充分混合后,4000r/min离心20min。
       ⑺ 沉淀(可直接冻干为粗提SPA制品)加PH7.4PBS液溶解,12000r/min离心20min。
       ⑻ 上清液即为粗提SPA液。
       ⑼ Sephadex G100过柱,上样后用0.05mol/L pH7.4 PBS液洗脱,流速控制在每管2ml~3ml/20min,收集流出液。
       ⑽ 测OD275nm值及用对流免疫电泳检测每管的活性,将有活性的各管合并、浓缩或冻干。
2.溶菌酶消化法
       ⑴ 将培养的SPA菌以pH 8.0 0.02mol/L Tris-HCl缓冲液配成10%~15%的悬液。
       ⑵ 按20:1(W/W)的量加入SPA菌液与溶菌酶(活力为1万U/mg蛋白)37℃水溶搅拌24h。
       ⑶ 置4℃冷却后,以12000g离心30min。
       ⑷ 取上清,调pH值至7.0。
       ⑸ 加硫酸铵,边加边搅拌,使溶液呈80%的饱和度,4℃过夜。
       ⑹ 12000g离心30min。
       ⑺ 以少量蒸馏水将沉淀溶解。

       ⑻ 透析或过Sephadex G50除盐,即为粗制的SPA制品。

       

       以上是SPA蛋白提取方法整合

       (本文转载百度学术)


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